结果表明：绿色荧光标记的 GLPlR已经成功整合到 Rin-m5F中，并稳定表达。非 GLPlR靶点药物格列本脲处理组细胞内无明显荧光斑点，未能激活模型;GLPlR激动剂药物百泌达处理组细胞内绿色荧光明显聚集成荧光斑点，激活模型。因此该模型建立成功，能用于筛选 GLPlR激动剂类药物。
4、讨论
目前大部分以 GLPlR为靶点构建的高通量激动剂筛选模型的设计原理是根据 GLPlR信号途径的特点来设计，主要可以分为以下 3 个方面[15] ：① 基于受体与配体结合原理构建模型：荧光微体积测定技术、荧光偏振法;② 基于检测胞内第二信使 cAMP构建模型：竞争性酶联免疫吸附检测法、闪烁邻近测定法、载黑色素细胞测定法;③ 基于受体功能反应构建报告基因构建模型：陈家琪等[16]在 CHO细胞中稳定转染带有增强型789中南药学 2017 年 6 月 第 15 卷 第6 期 Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和 GLP1R，殷菲等[17]利用 GLPlR和报告基因在 PC12 细胞中建立稳定的GLPlR激动剂筛选模型。这 3 个方面设计的筛选模型各有特色，受体——配体结合分析检测方法缺点是成本高且不能识别是配体是激动还是拮抗剂;检测 cAMP的筛选模型要求裂解细胞释放出胞内的 cAMP，且还需洗涤除去未结合的标记 cAMP;报告基因筛选模型常需要作用底物或者辅助因子，筛选成本高。本实验中选用 Rin-m5F作为宿主细胞是基于GLPlR 激动剂类药物治疗糖尿病的主要作用靶点位于胰岛细胞上，这样笔者的筛选模型能更加贴切反应药物治疗糖尿病时的生理机能。采用直接标记 GLPlR C端，使靶蛋白可视化，通过观察胞内荧光变化就能直观反应受体被激活，具有极大降低假阳性的优势。高内涵筛选平台是近年发展起来的新的筛选模式，通过采集荧光图像，综合运用高分辨率的荧光数码影像技术、数理统计分析方法等模板在单一实验中反应被测样品的生物活性、药代动力学性质和潜在毒性等。该筛选技术的优势在于所有的检测能在活细胞内进行，筛选速度快。本文建立的基于荧光标记使靶向蛋白可视化的原理，使该模型符合高内涵筛选平台的基本要求，为筛选 GLPlR 激动剂的高通量筛选奠定了坚实的基础。该模型能应用于混合物样品 GLP1 类似物小分子药物的筛选，具有假阳性极低、筛选所需样本小、筛选样品量大、易标准化、筛选速度快、特异性强等优势。同时这种研究模式为我国中药分子机制提供新的思路，为我国中药实现复方创新、早期评价、早期淘汰等目标提供便捷。参考文献[1] 中华医学会糖尿病学分会 . 中国 2 型糖尿病防治指南(2007 年版)[J]. 中华医学杂志，2008，88(18)：1227-1245.[2] LiuD，Darville M，Eizirik DL. Double-stranded ribonu-cleic acid(RNA)induces beta-cell Fas messenger RNAexpression and increases cytokine-induced beta-cell apopto-sis [J]. Endocrinology，2001，142(6)：2593-2599.[3] Liu D，Pavlovic D，Chen MC，et al. Cytokines induceapoptosis in beta-cells isolated from mice lacking the induc-ible isoform of nitric oxide synthase(iNOS-/-)[J]. Diabe-tes，2000，49(7)：1116-1122.[4] Muoio DM，Newgard CB. Mechanisms of disease：Mo-lecular and metabolic mechanisms of insulin resistance andbeta-cell failure in type 2 diabetes [J]. Nat Rev Mol CellBiol，2008，9(3)：193-205.[5] 钱荣立 . 关于糖尿病的新诊断标准与分型[J]. 中国糖尿病杂志，2000，8(1)：5-6.[6] 姚君厘，杨永年 . 糖尿病并发症感染及其危险因素分析[J]. 中华医院感染学杂志，1998，8(4)：216-218.[7] Bahtiyar G，Gutterman D，Lebovitz H. Heart failure：amajor cardiovascular complication of diabetes mellitus [J].Current Diabetes Reports，2016，16(11)：116-130.[8] Bril F，Cusi K. Nonalcoholic fatty liver disease：The newcomplication of type 2 diabetes mellitus [J]. Endocrinol Me-tab Clin North Am，2016，45(4)：765-781.[9] Bo AE. Islet G protein-coupled receptors as potential targetsfor treatment of type 2 diabetes [J]. Nature Reviews DrugDiscovery，2009，8(5)：369-385.[10] 闫荣，杨子义 . 胰高血糖素样肽 -1 类似物新药的研发进展[J]. 中国生物制品学杂志，2011，24(7)：866-868.[11] 毛黎静，安春红，张贝娜，等 . 新型糖尿病治疗药物的研究进展[J]. 中南药学，2017，15(1)：88-91.[12] 盛灵通，孔建龙，秦健，等 . GLP-1 及其类似物治疗糖尿病的研究进展[J]. 糖尿病新世界，2015，(2)：22-23.[13] Lai X，Kang X，Zeng L，et al. The protective effectsand genetic pathways of thorn grape seeds oil against highglucose-induced apoptosis in pancreatic β -cells [J]. BMCComplem Altern M，2014，14(1)：10-17.[14] Wu Y，Wang X，Guo H，et al. Synthesis and screeningof 3-MA derivatives for autophagy inhibitors. [J]. Autopha-gy，2013，9(4)：595-603.[15] 许芳芳，王楠，李刚强，等 . 人胰高血糖素样肽 -1 的研究与应用进展[J]. 生物技术通报，2016，32(6)：30-37.[16] 陈家琪，高智慧，朱元元，等 . 重组胰高血糖素样肽 -1与人血清白蛋白融合蛋白的纯及活性研究[J]. 微生物学通报，2007，34(5)：871-874.[17] 殷菲，邓小红，景佳佳，等 . 胰高血糖素样肽 1 受体激动的高通量筛选及作用机制研究[J]. 中国药学杂志，2007，42(1)：24-27.
