​东波教授论文（GLP1R-GFP稳定转染 Rin-m5F 细胞系的构建）(4)

　　⑧ 当 24 孔板内细胞密度达到 80%以上时，消化细胞移入 T-25 细胞培养瓶中扩大培养。

　　⑨冻存细胞，备用。

　　2.5　Western blot检验

　　在 6 孔板内分别接种相同数目的 Rin-m5F野生型细胞和步骤“2.4”项下获得的Rin-m5F/GLP1R-GFP单克隆细胞株，在完全培养液中培养至细胞密度长至90%左右。PBS 洗 2 遍，每孔加 200 μL2%SDS 裂解液，收取蛋白样品。置于 100℃水浴 10 min，加入 40μL的 6× 上样 Buffer稀释，置于 100℃水浴 10 min。Western blot实验方法见参考文献[14] 。

　　2.6　模型验证

　　实验分为空白对照(完全培养基)、溶剂对照(培养基加入 1%PBS、1%酒精、1%DMSO)、阳性对照(GLP1R 靶点药剂，百泌达)、阴性对照(非 GLP1R靶点药剂，格列本脲)。不同浓度药物处理相同时间：浓度设置为 0.25、0.5、2.5、5 μg·mL- 1 ，均处理 1 h。相同浓度药物处理不同时间：药物浓度为 0.25μg·mL- 1 ，分别处理 10、20、40、120 min。

　　操作流程：

　　① 将无菌圆形玻片在酒精灯火焰上来回灼烧数次，冷却后平铺在 24 孔板内，每孔一片;

　　②取“2.4”项下获得的单克隆细胞 Rin-m5F/GLP1R-GFP接种于圆形玻片上，轻轻摇晃培养板，使细胞均匀分布在板内，过夜至细胞密度长至 85%以上;

　　③ PBS 洗2 遍，加入含不同浓度药物的培养基 37℃孵育不同时间;

　　④ 吸弃培养液，PBS 洗 3 遍。加入 500 μL 4%多聚甲醛固定细胞 10 min，吸弃，PBS 洗 3 遍;

　　⑤ 取洁净载玻片，滴加 20 μL防荧光淬灭粘片剂，用镊子轻轻夹起圆形玻片，轻轻倒扣在防荧光淬灭粘片剂上，防止气泡产生;

　　⑥ 将玻片置于暗室通风干燥过夜，制好的玻片于激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

　　2.7　数据统计与分析

　　采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。数据以均数 ± 标准差(x±s)表示，组间采用单因素方差分析，各组均数都采用 LSD(Least-significant differencetest)检测，若 P < 0.05 为差异有统计学意义。

　　3、结果

　　3.1　细胞形态观察

　　细胞 Rin-m5F复苏时在显微镜下观察，细胞基本呈单个、圆形均匀分布在新鲜完全培养基内，细胞密度为 50%左右，培养基中无明显杂质。过夜培养后，细胞贴壁率为 90%以上，细胞轮廓清晰、多呈不规则形状分布，多呈岛状聚集铺开生长。经胰酶消化，显微镜下观察显示细胞逐渐变圆，细胞间开始出现间隙。吹打成单个以 1∶3 传代至 3 代时，细胞形态正常、生长速率恢复到最佳，每 2 ～ 3 日即可传代(见图 1)。

　　图 1　Rin-m5F细胞显微镜观察图(200×)

　　Fig 1　Micro-observation of Rin-m5F cell lines(200×)

　　3.2　转染及其体系优化

　　转染时在细胞接种量、质粒∶转染试剂 2 个方面进行优化，转染 24 h 后，倒置荧光显微镜下观察转染成功的细胞整个分布绿色荧光、荧光强度不一。拍照、统计转染效率分别见表 1。

　　表 1　转染效率Tab 1　Transfection efficiency

　　3.3　选择合适的 G418 筛选浓度